Was ist CRISPR?

CRISPR-Technologie ist ein einfaches, aber leistungsstarkes Werkzeug zum Bearbeiten von Genomen. Es ermöglicht den Forschern, DNA-Sequenzen leicht zu verändern und die Genfunktion zu modifizieren. Zu den zahlreichen möglichen Anwendungen gehören die Korrektur genetischer Defekte, die Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten sowie die Verbesserung der Kulturpflanzen. Das Versprechen wirft jedoch auch ethische Bedenken auf.

In der populären Verwendung ist "CRISPR" (ausgesprochen "crisper") Abkürzung für "CRISPR-Cas9". CRISPRs sind spezialisierte DNA-Abschnitte. Das Protein Cas9 (oder "CRISPR-assoziiert") ist ein Enzym, das wie ein Paar molekularer Scheren wirkt, die DNA-Stränge schneiden können.

Die CRISPR-Technologie wurde aus den natürlichen Abwehrmechanismen von Bakterien und Archaea (der Domäne einzelliger Mikroorganismen) adaptiert. Diese Organismen verwenden CRISPR-abgeleitete RNA und verschiedene Cas-Proteine, einschließlich Cas9, um Angriffe durch Viren und andere Fremdkörper zu vereiteln. Sie tun dies hauptsächlich, indem sie die DNA eines fremden Eindringlings zerhacken und zerstören. Wenn diese Komponenten in andere, komplexere Organismen übertragen werden, erlaubt dies die Manipulation von Genen oder "Editing".

Bis 2017 wusste niemand wirklich, wie dieser Prozess ausgesehen hat. In einer am 10. November 2017 in der Fachzeitschrift Nature Communications veröffentlichten Studie zeigte ein Forscherteam um Mikhiro Shibata von der Kanazawa University und Hiroshi Nishimasu von der Universität Tokio, wie es aussieht, wenn ein CRISPR zum ersten Mal in Aktion tritt Zeit. [Ein atemberaubendes neues GIF zeigt, wie CRISPR DNA kaut]

CRISPR-Cas9: Die Hauptakteure

CRISPRs: "CRISPR "steht für" Cluster von regelmäßig beabstandeten kurzen palindromischen Wiederholungen. "Es ist eine spezialisierte Region der DNA mit zwei verschiedenen Eigenschaften: die Anwesenheit von Nukleotid-Repeats und Spacern Wiederholte Sequenzen von Nukleotiden - die Bausteine ​​der DNA - sind in einem CRISPR verteilt Region sind Abstandsstücke von DNA, die sich zwischen diesen wiederholten Sequenzen befinden.

Im Fall von Bakterien werden die Abstandshalter von Viren genommen, die zuvor den Organismus angegriffen haben. Sie dienen als eine Bank von Erinnerungen, die es Bakterien ermöglichen, die Viren zu erkennen und zukünftige Angriffe abzuwehren.

Dies wurde erstmals experimentell von Rodolphe Barrangou und einem Team von Forschern bei Danisco, einem Unternehmen für Lebensmittelzusatzstoffe, nachgewiesen. In einem 2007 veröffentlichten Artikel in der Zeitschrift Science verwendeten die Forscher Streptococcus thermophilus Bakterien, die häufig in Joghurt und anderen Milchkulturen gefunden werden, als ihr Vorbild. Sie beobachteten, dass nach einem Virusangriff neue Spacer in die CRISPR-Region eingebaut wurden. Darüber hinaus war die DNA-Sequenz dieser Spacer identisch mit Teilen des Virusgenoms. Sie manipulierten auch die Abstandshalter, indem sie sie herausnahmen oder neue virale DNA-Sequenzen einfügten. Auf diese Weise konnten sie die Resistenz der Bakterien gegenüber einem Angriff durch ein spezifisches Virus verändern. So bestätigten die Forscher, dass CRISPR eine Rolle bei der Regulierung der bakteriellen Immunität spielen.

CRISPR-RNA (crRNA): Sobald ein Spacer inkorporiert ist und das Virus erneut angreift, wird ein Teil des CRISPR transkribiert und zu CRISPR-RNA oder "crRNA" verarbeitet. Die Nucleotidsequenz des CRISPR wirkt als eine Matrize, um eine komplementäre Sequenz einzelsträngiger RNA zu erzeugen. Jede CrRNA besteht aus einem Nucleotid-Repeat und einem Spacer-Anteil, wie eine 2014 erschienene Rezension von Jennifer Doudna und Emmanuelle Charpentier in der Fachzeitschrift Science beschreibt.

Cas9: Das Cas9-Protein ist ein Enzym, das fremde DNA schneidet.

Das Protein bindet typischerweise an zwei RNA-Moleküle: crRNA und ein anderes, das als tracrRNA (oder "transaktivierende crRNA") bezeichnet wird. Die beiden führen dann Cas9 zum Zielort, wo es seinen Schnitt macht. Diese DNA-Ausdehnung ist komplementär zu einem 20 Nukleotide langen Abschnitt der crRNA.

Mit zwei getrennten Regionen oder "Domänen" auf seiner Struktur schneidet Cas9 beide Stränge der DNA-Doppelhelix, was einen sogenannten "doppelsträngigen Bruch" nach dem Science-Artikel von 2014 ergibt.

Es gibt einen eingebauten Sicherheitsmechanismus, der sicherstellt, dass Cas9 nicht nur irgendwo in einem Genom schneidet. Kurze DNA-Sequenzen, die als PAMs bekannt sind ("Protospacer-benachbarte Motive") dienen als Markierungen und sitzen benachbart zu der Ziel-DNA-Sequenz. Wenn der Cas9-Komplex kein PAM neben seiner Ziel-DNA-Sequenz sieht, schneidet er nicht. Dies ist ein möglicher Grund dafür, dass Cas9 die CRISPR-Region in Bakterien nicht angreift, so eine 2014 in Nature Biotechnology veröffentlichte Studie.

CRISPR-Cas9 als Genom-Editing-Tool

Die Genome verschiedener Organismen codieren eine Reihe von Nachrichten und Anweisungen innerhalb ihrer DNA-Sequenzen. Beim Bearbeiten von Genomen werden diese Sequenzen geändert, wodurch die Nachrichten geändert werden. Dies kann geschehen, indem man einen Schnitt oder Bruch in die DNA einfügt und die natürlichen DNA-Reparaturmechanismen einer Zelle dazu bringt, die gewünschten Veränderungen herbeizuführen. CRISPR-Cas9 bietet hierfür eine Möglichkeit.

Im Jahr 2012 wurden zwei zentrale Forschungsarbeiten in den Fachzeitschriften Science und PNAS veröffentlicht, die dazu beitrugen, bakterielles CRISPR-Cas9 in ein einfaches, programmierbares Genom-Editing-Tool zu verwandeln.

Die Studien, die von getrennten Gruppen durchgeführt wurden, kamen zu dem Schluss, dass Cas9 angewiesen werden könnte, jede DNA-Region zu schneiden. Dies könnte getan werden, indem einfach die Nucleotidsequenz von crRNA, die an ein komplementäres DNA-Target bindet, geändert wird. In dem Science-Artikel von 2012 vereinfachten Martin Jinek und Kollegen das System weiter, indem sie crRNA und tracrRNA fusionierten, um eine einzelne "Führungs-RNA" zu erzeugen. Daher benötigt die Genombearbeitung nur zwei Komponenten: eine Guide-RNA und das Cas9-Protein.

"Operationell entwirfst du eine Strecke von 20 Nucleotid-Basenpaaren, die mit einem Gen übereinstimmen, das du bearbeiten willst", sagte George Church, Professor für Genetik an der Harvard Medical School. Ein zu diesen 20 Basenpaaren komplementäres RNA-Molekül wird konstruiert.Church betonte die Wichtigkeit sicherzustellen, dass die Nukleotidsequenz nur im Zielgen und nirgendwo sonst im Genom gefunden wird. "Dann schneidet die RNA plus das Protein [Cas9] - wie eine Schere - die DNA an dieser Stelle und idealerweise nirgendwo sonst", erklärte er.

Sobald die DNA geschnitten ist, treten die natürlichen Reparaturmechanismen der Zelle ein und wirken, um Mutationen oder andere Veränderungen des Genoms einzuleiten. Es gibt zwei Möglichkeiten, wie dies passieren kann. Laut dem Huntington Outreach Project in Stanford (University) besteht eine Reparaturmethode darin, die beiden Schnitte wieder zusammen zu kleben. Diese Methode, die als "nicht-homologe Endverbindung" bekannt ist, neigt dazu, Fehler einzuführen. Nukleotide werden versehentlich eingefügt oder deletiert, was zu Mutationen führt, die ein Gen stören könnten. Bei der zweiten Methode wird die Unterbrechung durch Ausfüllen der Lücke mit einer Nukleotidsequenz festgelegt. Um dies zu tun, verwendet die Zelle einen kurzen DNA-Strang als Vorlage. Wissenschaftler können die DNA-Vorlage ihrer Wahl liefern und dabei jedes beliebige Gen einschreiben oder eine Mutation korrigieren.

Nutzen und Einschränkungen

CRISPR-Cas9 ist in den letzten Jahren populär geworden. Church stellt fest, dass die Technologie einfach zu benutzen ist und etwa viermal effizienter ist als das bisher beste Genom-Editing-Tool (TALENS).

Im Jahr 2013 wurden die ersten Berichte über die Verwendung von CRISPR-Cas9 zur Bearbeitung menschlicher Zellen in einer experimentellen Umgebung von Forschern aus den Labors von Church und Feng Zhang vom Broad Institute des Massachusetts Institute of Technology und Harvard veröffentlicht. Studien mit In-vitro- (Labor-) und Tiermodellen für menschliche Krankheiten haben gezeigt, dass die Technologie bei der Korrektur genetischer Defekte wirksam sein kann. Beispiele für solche Krankheiten sind Mukoviszidose, Katarakte und Fanconi-Anämie, so ein Artikel aus dem Jahr 2016, der in der Zeitschrift Nature Biotechnology veröffentlicht wurde. Diese Studien ebnen den Weg für therapeutische Anwendungen am Menschen.

"Ich glaube, dass die öffentliche Wahrnehmung von CRISPR sich sehr auf die Idee konzentriert, das Gen-Editing klinisch zur Heilung von Krankheiten einzusetzen", sagte Neville Sanjana vom New York Genome Center und Assistenzprofessor für Biologie, Neurowissenschaften und Physiologie an der New York University. "Dies ist zweifellos eine aufregende Möglichkeit, aber das ist nur ein kleines Stück."

Die CRISPR-Technologie wurde auch in der Lebensmittel- und Agrarindustrie eingesetzt, um probiotische Kulturen zu entwickeln und industrielle Kulturen (z. B. für Joghurt) gegen Viren zu impfen. Es wird auch in Kulturpflanzen verwendet, um Ertrag, Trockenheitstoleranz und ernährungsphysiologische Eigenschaften zu verbessern.

Eine weitere mögliche Anwendung ist die Erstellung von Gen-Drives. Dies sind genetische Systeme, die die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass ein bestimmtes Merkmal von den Eltern auf die Nachkommen übergeht. Im Laufe der Generationen verbreitet sich das Merkmal nach Angaben des Wyss-Instituts über ganze Bevölkerungsgruppen. Gene drives können helfen, die Ausbreitung von Krankheiten wie Malaria zu kontrollieren, indem die Sterilität unter dem Krankheitsvektor - weiblich - erhöht wird Anopheles gambiae Moskitos - laut dem Artikel der Nature Biotechnology 2016. Darüber hinaus könnten Gentransporte auch dazu verwendet werden, invasive Arten zu eliminieren und die Resistenz gegen Pestizide und Herbizide umzukehren, wie aus einem Artikel von Kenneth Oye und Kollegen von 2014 hervorgeht, der in der Fachzeitschrift Science veröffentlicht wurde.

CRISPR-Cas9 ist jedoch nicht ohne Nachteile.

"Ich denke, die größte Einschränkung von CRISPR ist, dass sie nicht hundertprozentig effizient ist", sagte Church gegenüber Live Science. Darüber hinaus kann die Genom-Editing-Effizienz variieren. Laut dem Science-Artikel 2014 von Doudna und Charpentier fand eine Genstudie in einer Studie, die mit Reis durchgeführt wurde, in fast 50 Prozent der Zellen statt, die den Cas9-RNA-Komplex erhielten. Andere Analysen haben jedoch gezeigt, dass die Effizienz der Bearbeitung je nach Ziel bis zu 80 Prozent oder mehr erreichen kann.

Es gibt auch das Phänomen der "Off-Target-Effekte", wo DNA an anderen Stellen als dem beabsichtigten Ziel geschnitten wird. Dies kann zur Einführung von unbeabsichtigten Mutationen führen. Des Weiteren stellte Church fest, dass es selbst dann, wenn das System das Ziel erreicht, eine Chance gibt, keine präzise Bearbeitung zu erhalten. Er nannte das "Genom-Vandalismus".

Grenzen setzen

Die vielen möglichen Anwendungen der CRISPR-Technologie werfen Fragen über die ethischen Vorzüge und Folgen der Manipulation von Genomen auf.

Im Science Artikel von 2014 weisen Oye und Kollegen auf die möglichen ökologischen Auswirkungen von Genantriebssystemen hin. Eine eingeführte Eigenschaft könnte sich über die Zielpopulation durch Kreuzung auf andere Organismen ausbreiten. Gene drives könnten auch die genetische Vielfalt der Zielpopulation reduzieren.

Genetische Modifikationen an menschlichen Embryonen und Fortpflanzungszellen wie Sperma und Eiern sind als Keimbahn-Bearbeitung bekannt. Da Änderungen an diesen Zellen an nachfolgende Generationen weitergegeben werden können, hat die Verwendung der CRISPR-Technologie, um Keimbahn-Editierungen vorzunehmen, eine Reihe von ethischen Bedenken aufgeworfen.

Variable Wirksamkeit, Off-Target-Effekte und ungenaue Bearbeitungen sind Sicherheitsrisiken. Darüber hinaus gibt es vieles, was der wissenschaftlichen Gemeinschaft noch unbekannt ist. David Baltimore und eine Gruppe von Wissenschaftlern, Ethikern und Rechtsexperten stellen in einem Artikel aus dem Jahr 2015 fest, dass Keimbahn-Editing die Möglichkeit unbeabsichtigter Konsequenzen für zukünftige Generationen erhöht, "weil unser Wissen über Humangenetik, Gen-Umwelt-Interaktionen begrenzt ist. und die Wege der Krankheit (einschließlich des Zusammenspiels zwischen einer Krankheit und anderen Zuständen oder Krankheiten bei demselben Patienten). "

Andere ethische Bedenken sind differenzierter. Sollten wir Veränderungen vornehmen, die zukünftige Generationen grundlegend beeinflussen könnten, ohne ihre Zustimmung zu haben? Was ist, wenn sich die Verwendung der Keimbahnbearbeitung von einem therapeutischen Werkzeug zu einem Verbesserungsinstrument für verschiedene menschliche Eigenschaften entwickelt?

Um diesen Bedenken Rechnung zu tragen, verfassten die Nationalen Akademien für Wissenschaft, Technik und Medizin einen umfassenden Bericht mit Leitlinien und Empfehlungen für die Genombearbeitung.

Obwohl die National Academies bei der Verfolgung von Keimbahn-Editierungen Vorsicht walten lassen, betonen sie, dass "Vorsicht nicht Verbot bedeutet". Sie empfehlen, dass Keimbahn-Editing nur an Genen vorgenommen wird, die zu schweren Erkrankungen führen, und nur dann, wenn es keine anderen vernünftigen Behandlungsalternativen gibt. Unter anderem betonen sie die Notwendigkeit, Daten über die gesundheitlichen Risiken und Vorteile sowie über die Notwendigkeit einer kontinuierlichen Überwachung während der klinischen Studien zu haben. Sie empfehlen auch, Familien über mehrere Generationen hinweg weiterzuverfolgen.

Neuere Forschung

Es hat viele neue Forschungsprojekte rund um CRISPR gegeben. "Das Tempo der Entdeckungen in der Grundlagenforschung ist dank CRISPR explodiert", sagte Sam Sternberg, Biochemiker und CRISPR-Experte, der Gruppenleiter der Technologieentwicklung der in Berkeley, Kalifornien, ansässigen Caribou Biosciences Inc., die CRISPR-basierte Lösungen für die Medizin entwickelt. Landwirtschaft und biologische Forschung.

Hier sind einige der neuesten Erkenntnisse:

  • Im April 2017 veröffentlichte ein Forscherteam in der Fachzeitschrift Science, dass sie ein CRISPR-Molekül programmiert hatten, um Virusstämme wie Zika in Blutserum, Urin und Speichel zu finden.
  • Am 2. August 2017 enthüllten Wissenschaftler in der Zeitschrift Nature, dass sie einen Herzkrankheitsdefekt in einem Embryo erfolgreich mit CRISPR entfernt hatten.
  • Am 2. Januar 2018 kündigten Forscher an, dass sie in der Lage sein könnten, Pilze und andere Probleme zu stoppen, die die Schokoladenproduktion mit CRISPR bedrohen, um die Pflanzen widerstandsfähiger gegen Krankheiten zu machen.
  • Am 16. April 2018 verbesserten die Forscher CRISPR, um Tausende von Genen gleichzeitig zu bearbeiten, so eine von der Zeitschrift BioNews veröffentlichte Studie.

Zusätzliche Ressourcen

Schau das Video: Gen-editing mit CRISPR/Cas9 (english subtitles)

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